徠卡顯微鏡系統
雷射掃描共軛焦顯微鏡
半導體及工業用顯微鏡
顯微數位影像系統
細胞基因影像分析系統
其它光電微機電系統
其它生醫研究儀器
維修與技術支援服務
聯絡與留言
　
　
　 了解 Leica 在 Super-Resolution 的解決方案 與 領導趨勢 ..
　 　
　
　
多一點了解 Leica TCS SP5 的卓越, 與其他產品的差異性在哪裡 ?

The Leica TCS SMD FLIM system is part of the Leica TCS SMD Series.

It is a dedicated system for FLIM measurements. These measurements reveal information about the direct neighborhood of molecules on the nanometer scale.

Local conditions can determine folding states that influence the reactivity of molecules. FLIM is also used for binding studies (FLIM-FRET) and to identify natural metabolites under physiological conditions. The SMD FLIM wizard optimizes FLIM measurement conditions and allows the setup of FLIM time series or FLIM stacks

The Leica TCS SMD Series integrates hardware and software from PicoQuant with the high-end confocal system Leica TCS SP5 II. Researchers can now control a complete SMD experiment via one interface, the LAS AF software from Leica Microsystems. The coordination of different hardware and software components for one SMD experiment is now a thing of the past.

Field upgrades of Leica TCS SP5 and SP5 II confocal systems to any of the Leica TCS SMD systems, FCS, FLIM and FLCS, are possible

時間解析螢光技術 (Time-demand Fluorescence Technology)

螢光技術應用於研究領域中已經十分成熟，人們可以藉由簡單的螢光波長變化做為區分，例如以不同的螢光染劑針對細胞中不同的部位標訂，並以個別波長的激發光及螢光訊號波段擷取，便可以獲得細胞不同區域的影像，DAPI染細胞核、FITC染細胞骨架、TRITC染粒線體等，藉由疊圖將整片影像呈現出來。(圖為共軛焦螢光影像)。或是由螢光光強的改變來獲得資訊，例如在某些區域中螢光的表現量多寡判斷細胞變化，以及Intensity base FRET (Förster Resonance Energy Transfer)，可藉由Donor-Accepter間共振的能量轉換獲得螢光強弱的改變，獲得蛋白質間交互作用以及生物資訊。

　

　
　 　

同一時間，光學技術也不斷演進，共軛焦顯微技術(Confocal Microscope)技術由不可能變成可能，更進一步成為一項方便的使用工具，另外雷射光的發展、光電倍增管技術(Photomultiplier tube, PMT)技術成熟、AOBS (Acousto-Optical Beam Splitter)等各項技術都成為螢光影像上的得力助手。

但是螢光波長以及光強的改變是最容易被人感覺差異，也是最直接的觀測方式。然而當螢光染劑的波長太過相近或是微弱的螢光訊號，就無法使用傳統的顯微技術做量測，因此由以下的技術發展。

目前, 研究界針對螢光壽命測定的方法, 有三種 :

1. 即時相關單分子計數法 ( Time-correlated Single Photon Counting, TCSPC ).

2. 頻域法 - 相調制法. Frequency-domain ( phase modulation ) method.

3. 頻閃技術 ( Strobe techniques )

　

FLIM 技術介紹與應用

Fluorescence Lifetime Image Microscopy (螢光生命週期影像顯微技術、以下簡稱FLIM)是計算螢光分受激發後，電子的停留在激發態的時間，累積疊加後趨近(Fitting)的結果。當原本在基態的分子在接受到激發光光子躍遷到激發態的時候，大約會停留1到100 ns (10-9-10-7秒)，依照不同的螢光分子、不同的機制，會造成留滯時間的不同，可以用來判斷光譜相近但lifetime不同的螢光染劑。

FLIM量測需要以下三項技術的配合

1.      脈衝雷射(Pulse Laser)

FLIM要量測Lifetime的時間，需要時間的零點以及時間軸來計算Lifeitme，因此脈衝雷射變是最主要的激發光源，同時也是時間長短的定義，以80MHz的脈衝雷射為例，在一秒鐘會有八千萬發脈衝，所以脈衝間的時間間隔大約為12.5 ns，利用脈衝雷射獲得時間間距，同時脈衝雷射做為螢光的激發，便可以累積在不同時間點被偵測到的光子訊號。因此脈衝雷測的脈衝寬度(Pulse Duration)越短越好，可以減少After Pulse的螢光訊號被Detector收到，而影響Lifetime的計算。

2.      FLIM Detector

由於FLIM技術的螢光相當於單光子的累積，因此FLIM技術所使用的偵測器大多使用冷卻的PMT或是APD (Avalanche photodiode)來做為螢光訊號的接受。冷卻技術可以確保S/N Ratio，增加FLIM量測的準確性。並且需要將偵測器與FLIM的技術量測元件做適當的連結，才可以獲得準確的Lifetime訊號。

3.      TCSPC

TCSPC (Time Correlated Single Photon Counting)是FLIM技術的核心，脈衝雷射的脈衝輸入與光子訊號到達偵測器時，TCSPC量測並累積之後便可以獲得螢光光強隨時間的Decay曲線。以自然對數的方程式逼近獲得螢光生命。

其中I (t)是光子數時間的函數，I0是原始光強，τ是螢光的Lifetime，t是時間。由於光強的衰減是以自然對數的行事，因此通常光子數會歸一化，並且是以級數的方式呈現。

FLIM特別應用於量測光譜無法分析的螢光分子，舉例來說，如果今天有兩個螢光分子同時染在一個區域中，但是激發與放射光譜十分相近，可以利用FLIM的技術做為區別。另外螢光染劑對於微小的環境變化有很大的反應，在pH、離子濃度、溫度及極性等條件的改變下，會出現螢光Lifetime的變化，更加容易觀測。

在 Leica TCS SMD FLIM 系統的設計下，所有的內建 cooled PMT detector 均為水冷式設計，能有效提高S/N比例。可以由使用者端視狀況及需求，可選擇405 nm、470 nm 或是 640 nm 的單分子脈衝雷射，或是可調變式多光子 IR 雷射 (680-1040 nm)，端看使用者的需求。

Leica的作業系統承襲著以往的慣例，成功將所有的FLIM軟體整合成為在單一使用介面，讓使用這無須疲於更換操控電腦，並利用 Leica 的軟體，讓使用者可以輕鬆的使用內建套件來量測 FLIM，確保使用者實驗正確及完整。

　
　
　
Leica TCS SP5 II Scan Head 圖示
Flexibility to meet your needs  ( D-FLIM, MP-FLIM )
Leica TCS SMD FLIM 可以讓使用者在實驗規畫中, 選擇採用 D-FLIM 或  MP-FLIM. 發揮最高使用效益.

D-FLIM 採用 脈衝式  405 nm , 470 nm, 640 nm 雷射作為機發光源.

MP-FLIM 採用紅外光飛秒雷射  ( Pico or Femto second ).
Quick Results and better data reliability
即時快速的 FLIM 影像成像, 足以在實驗過程中, 即時執行高速的螢光光子計數速率.
Explore even complex fluorescence properties
結合 FLIM 量測分析的光譜式共軛焦顯微影像系統, 可以探測分子間的交互作用, 分子間距, 分子間的奈米級環境變化反應, 藉以探知複雜的分子動態變化.
Ready for upgrade to FLCS
Leica TCS SMD FLIM 系統, 內置 PDM (Photo Diode Module) APDs , 唯一可直接在 TCS SP5 II 上, 在 FLIM 的基礎, 直接升級到  FCS (Fluorescence Correlation Spectroscopy) 系統, 成為全世界唯一的全光譜式共軛焦影像系統 - TCS SMD FLCS (Fluorescence Lifetime Correlation Spectroscopy) System.

一般 FLIM 常見的應用領域包括 :

Non-stained samples:

  • Metabolic state characterization
  • Cancer research: identification of modified cells
  • Plant physiology: pathogen-host interaction
  • Identification of chitin of lignin structures

Stained samples:

  • Energy transfer (FLIM-FRET for molecule binding)
  • Molecular sub-states (e.g. isomerization, protonation)
  • Local concentration of ions and small ligands
  • Environmental studies (viscosity, refractive index, pH)
  • Dye separation
  • Photophysical dye properties

　
Leica TCS SMD FLIM 相關資料下載
Leica TCS SMD FLIM 規格與組配 下載 ( PDF )
Leica TCS SMD FLIM 原廠型錄 下載 ( PDF )
Leica TCS SP5 II 系統組配參考 下載 ( PDF )
　
Label-free FLIM application letter 應用技術與文獻 下載 ( PDF )
美嘉公司提供 LEICA Time-domain FLIM 以及 homodyne Frequency-domain FLIM ( Lambert LIFA system ). 頻率解析 螢光生命週期 之影像量測系統.

Lambert Instruments Fluorescence Attachment - LIFA

  • with modulated LED and modulated ICCD and user-friendly software
    optional: with directly     modulated diode laser as widefield light source

    　
  • combined to Yokogawa spinning disk for confocal microscopy FLIM images ( 結合高速掃描共軛焦的 FLIM 系統 )

    　
  • combined to laser-TIRF for FLIM images in TIRF mode  ( 結合螢光全反射的 FLIM 系統  )

OR

Build your own Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy 𨦉LIM system

  • add the modulated image intensifier II18MD, the key component of the LIFA (Lambert Instruments Fluorescence Attachment)

See our list of test sites where Lambert Instruments fluorescence lifetime imaging products are used and publications list LIFA / II18MD papers for references and information on possible applications.

The picture shows 4 HeLa cells with FRET (Alexa488 and Alexa568) only at the centrosomes (the microtubule organizing centers of the cell): the lifetime of Alexa488 at the centrosomes has decreased to 2,3ns, and the lifetime of Alexa488 outside the centrosomes is 2,7ns. The pseudo colored lifetime is merged with the gray scaled intensity image. Courtesy of Prof. Diaspro, Genua, Italy.

 

Other products in this category:

LIFA-X, for long lifetime phosphorescence imaging
LIFA - combined to Yokogawa spinning disk
LIFA - combined to laser-TIRF
 II18MD, modulated image intensifier
　

　
　 　
　
其他產品詳細資料, 請點選下列圖示.
　 　
Leica TCS STED Leica TCS STED CW Leica TCS SP5 CARS

Integrates Super Resolution STED with the Broadband Confocal Platform TCS SP5
Leica TCS STED.

With the award-winning invention of STED technology, a new chapter in fluorescence microscopy began 		　 The Fast Track to Superresolution !!! The new Leica TCS STED CW is the most uncomplex way to nanoscopy for research. The system resolves structures smaller than 80 nm – with purely optical methods............ 　 Coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy overcomes a powerful tool for three-dimensional, label-free imaging of chemical and biological samples in vitro and in vivo.
　 　
Leica TCS SP5 II Leica TCS SP5 X Leica TCS SP5 MP
The Only Broadband Confocal
Leica TCS SP5 II, The Leica TCS SP5 II Confocal covers a broad range of requirements in confocal and multiphoton imaging - with the full array of scan speeds at highest resolution ..........		 　 Tune into any Excitation with Supercontinuum Confocal Leica TCS SP5 X. With the Leica TCS SP5 X Supercontinuum Confocal researchers can tune excitation wavelengths to perfectly match fluorophores, turn down laser power, and thereby increase viability for longer live cell experiments ...... 　 Deep Imaging at Video Rate
Leica TCS SP5 MP...........
　 　
Leica TCS SMD FCS Leica TCS SMD FLIM Leica TCS SMD FLCS
The system acquires and analyzes FCS and FCCS (Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy) data. Both methods focus on quantitative analysis of transport and binding processes, in vitro as well as in vivo 　 It is a dedicated system for FLIM measurements. These measurements reveal information about the direct neighborhood of molecules on the nanometer scale 　 Fluorescence Lifetime Correlation Spectroscopy. This single molecule detection system ensures the highest flexibility in biophysics by conveniently combining FCS (Fluorescence Correlation Spectroscopy) and FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging) in one system................
　 　
Leica HCS A Leica TCS SPE II Leica TCS LSI
High Content Screening Automation. The combination of high-resolution true confocal point scanning technology with the ingenious LAS AF MATRIX M3 automation software for the first time offers high content screening on research microscopes. 　 The Leica TCS SPE confocal is a true point-scanning, spectral system at an affordable price for fluorescence imaging of live or fixed cells ........... 　 Capture Intra-vital Adult and Embryo Images from Macro to Micro with Leica TCS LSI. The first super zoom confocal that offers high resolution plus a large 16mm field of view for in vivo imaging
　 　
VT infinite 3 Pinhole array Confocal Scanner 　 Leica Structured Illumination Microscope 　 Leica 4Pi

Next-generation multi-point confocal scanner. Offers low photo-bleaching with high-speed image acquisition .......

 　

Structured Illumination solution allows image contrast improvement, image blur removal and optical sectioning in fluorescence applications

　 A innovative solution for Super-Resolution .......
   相關資料 ( Information )
雷射掃描共軛焦顯微鏡技術概論與應用介紹 ( CLSM Technology & Application )
Leica TCS 光譜式共軛焦顯微鏡的核心技術介紹 ( AOTF, AOBS, Spectral Detector )
Leica TCS 光譜式共軛焦顯微鏡的雷射光源 ( Laser system ) 介紹
Leica TCS 光譜式共軛焦顯微鏡的物鏡 ( Objectives ) 介紹
Leica TCS 光譜式共軛焦顯微鏡的應用軟體 ( Application Software ) 介紹
使用於共軛焦顯微鏡上的活細胞培養設備 ( Micro-incubation )
美嘉儀器股份有限公司 Major Instruments Co., Ltd.
台北總公司 : TEL : 02-2808-1452  FAX : 02-2808-2354  維修中心 : 02-2808-2353

高雄辦事處 - TEL : (07) 725-8177  FAX : (07) 725-8204

E-mail : major@major.com.tw    http://www.major.com.tw