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Leica
TCS SP2
雷射掃描共軛焦光譜顯微鏡系統 |
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台灣地區銷售安裝使用量最高的共軛焦顯微鏡
TCS SP2 !
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位於德國幽美的海德堡
(
Heidelberg )
徠卡公司,
延襲百年以上的顯微鏡光學設計技術,
以領先創新的共軛焦光學技術,
佐以共軛焦系統使用者的經驗,
歷經多年的研發,
繼
TCS
SP
成功的上市後,
於千禧年起,
推出了最新一代的
TCS
SP2
雷射掃描共軛焦分光光譜顯微鏡.
建立了共軛焦科技的另一里程碑.
Leica TCS SP2
AOBS 是最新一代的 "
完全光譜式 "
雷射掃描共軛焦顯微鏡系統,
其設計上,
有創新與重大的突破設計 -
突破光學元件的障礙 ( Breaking all the barriers !
) :
1).
激發光設計 ( Excitation )
( TCS SP2,
SP2-AOBS, SP2 RS )
完全採用可程式光波調控設計
( AOTF, Acousto Optical Tunable Filter, programmable
), 包括紫外光雷射,
可見光雷射,
紅外光雷射,
皆採用 AOTF
調控雷射光波選取與強度控制.
2).
分光設計
(
Beam splitter )
完全採用可程式光波調控設計
( TCS SP2 AOBS : AOBS, Acousto Optical Beam Splitter, programmable )
3).
釋放接收光譜設計
( Emission ) (
TCS SP2, SP2-AOBS, SP2 RS )
完全採用可程式光波調控設計
(
SP, Spectrophotometer, programmable )
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| The
Leica TCS SP2 light path |
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詳細
TCS SP2
光路圖示, 請點選連結. Leica
SP2 Brochures ( 0.46 MB PDF ) |
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Leica SP2 ( Confocal
Spectral Microscope ) 技術原理 |
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當光聚焦於樣品上,
其聚焦點的斷層面,
我們稱為聚焦面
( focus plane ). 聚焦點外的樣品層,
則稱為非聚焦面
( Out-of focus plane ). 利用通過光學針孔光圈
( Pinhole ) 蒐集來自樣品聚焦面的光所行成的影像,
將非同一聚焦面的光排除於光學針孔光圈外
( 如為擷取影像之黑色背景
) , 所形成的影像,
我們簡單的稱為共軛焦點
( 焦距
) 影像
( Confocal Image ) |
| 傳統的濾鏡式共軛焦系統
(
Filter ) |
第一代的
TCS SP 光譜式共軛焦系統
( Spectral ) |
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| 在傳統的濾鏡式共軛焦系統
( Filter-based ), 僅能使用為數有限的螢光濾鏡
( 例如,
6 – 8 個
), 而且,
又是波幅極寬的固定式濾鏡,
濾鏡又往往造成螢光訊號的嚴重折損.
所以,
難以發揮使用效益.
此外,
許多新一代的染劑,
都有新發現的波長,
傳統的濾鏡式共軛焦系統難以應用的上,
如要更換濾鏡,
所費不孳,
調整校準工作更是難以掌握,
費時費力.
也有些螢光染劑會因條件的不同,
如濃度,
酸鹼值,
而有所移位
( shift ), 要如何精確的測得其釋放光譜呢
? 當面對新一代的各種螢光蛋白時
( CFP, BFP, GFP, YFP, DsRED
), 其激發光譜與螢光釋放光譜都很接近,
彼此交互重疊情況極為普遍與嚴重.
要克服此感測技術屏阱,
分光光譜式的感測技術是目前最佳的解決技術 |
新一代的共軛焦系統,
是將通過感測光針孔的反射螢光,
經過一組特製的菱鏡
( Prism ) 產生連續的光譜
( 螢光釋放光譜
). 其可感測的光譜範圍廣達400
– 850 nm 間.
此設計替代了傳統的濾鏡及分光鏡.
因為,
光通過濾鏡的數目減少,
其光學穿透有效率更高,
影像更為鮮明,
解析更高.
平均來自樣品的反射螢光到達感測器時,
仍能提供
90% 以上的穿透率.
( Optical Transfer Efficiency ) |
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在掃描器內的
4 個感測器之前, 各有一組光譜調控柵門, 此柵門即控制感測光譜通過的波長範圍.
( 傳統濾鏡式的系統, 僅能使用少數的固定波段的濾鏡來篩選感測光譜 ) 只要調控此柵門的間距, 即可輕易的調整感測光譜範圍., 即是自行設計出無限的感測光濾鏡. 使用人員, 也可反過來, 指定某一光譜範圍, 供其自動掃描感測, 如 490 –
550 nm, 每一 step 為 2 nm. 所以, 應用此技術, 能真正的掌握每一螢光染劑的釋放光譜, 避免螢光交戶重疊
( crosstalk ), 也避免螢光漂白. 此技術也是唯一可作多重螢光的全光譜感測與呈像. 例如, 當您使用 GFP. BFP, YFP, ECFP 或
DsRed 時, 完全可輕易的清楚將螢光顏色分離顯示. ( 也有人使用 多通道的 PMT 作為感測器
– Leica 早已於 1995 年使用測試過, 並已放棄此種設計
– 此種日本 Hamamatsu 公司所設計的 32 通道 PMT, 有如百葉窗的區間感測法, 造成每個通道的波長間帶有重疊處, 而且無法於掃描時任意調控波長範圍, 所以, 基本上, 我們認為無法號稱為光譜式掃描
)
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光柵
( Slit ) :
位於每一個
PMT 之前,
取代螢光濾鏡與分光鏡.
可任意移位,
可任意移動柵門寬度,
即,
自行設定取決光譜範圍
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| 使用者可自行定義光譜偵測範圍
- 無限制的設定與存取.
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| 使用者可自行定義光譜偵測範圍
- 無限制的設定與存取.
可有效分離重疊的螢光訊號.
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| 無須軟體
UN-Mixing
處理,
即可有效分離幾近重疊的螢光訊號.
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| 可做光譜掃描,
量化螢光實際釋放光譜.
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Leica
TCS SP2共軛焦系統可供同時安裝使用
UV, Visible, IR (
Multi-Photon )
雷射.
其共軛焦掃描器內置
3
組雷射光源輸出口
(
如下圖所示
). TCS SP2
除外的共軛焦系統,
因僅有2
組雷射光源輸出口,
而且,
光學元件並無
UV
至
IR
的全光譜修正,
所以,
僅能安裝使用二組雷射,
如
UV-VIS
或者
VIS-IR.
並無法同時使用
UV-IR
或
UV-VIS-IR.
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| Leica
LCS 軟體 |
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| 新一代 唯一的
“ K-Scanner
“ 旋轉式
K 型 掃描器 |
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共軛焦系統的掃描鏡是一高速掃描的光學與機械組成的系統, 如, 每秒掃描近 2000 條掃描線. 所以, 震動, 疲疺, 光路失真, 光面不一, 等等雜訊會因長時間使用後, 相繼產生. 所以, 掃描及旋轉的力矩必須愈小愈好, 才無震動雜訊, 才適宜高速掃描與高速旋轉, 在 Patch-Clamp
應用時, 才不會因為有掃描鏡所產生的震動, 而造成實驗的困擾與失敗. ( 事實上, 有一些廠商雖說他們的共軛焦系統也能作掃描旋轉, 但是, 確有一些技術屏阱, 無法於高速掃描下, 作旋轉掃描. 而且, 因為是雙掃描鏡設計, 故光路產生雙掃描平面 ( plane ), 影響光學解析. 新一代徠卡的 旋轉式 K 型 掃描器 則無此問題, 能提供任何掃描速度的超高光學解析, 能保證單一掃描平面, 能完全進入鏡頭照明瞳孔, 以提供最高解析. 新一代的 K-scanner 能提供 多度空間的掃描 ( nD : multi-dimentional
scanning )
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唯一的微電腦自動控制調整鏡頭瞳孔照明
( Pupil Illumination )
照明光源能完全穩合所使用的各種鏡頭的瞳孔照明,
是一項極重要的光學解析技術.
簡單的講,
每個鏡頭都有其不同的照明瞳孔孔徑,
一般都是取
40x 鏡頭的瞳孔孔徑當作參考值
( 或其它一個鏡頭的孔徑
), 因而,
忽略了其它鏡頭的瞳孔照明.
如果,
當您使用較低強度的雷射時,
此種沒有穩合瞳孔照明的缺點,
會誤導使用人員,
而深深影饗實驗的工作,
例如,
過度加強雷射強度造成螢光漂白或樣品壞死.,
或者,
錯誤調整感測器靈敏度,
造成影像雜訊過高.
所以,
在可見光及紅外光雷射光源方面,
Leica TCS SP2 已有最佳瞳孔照明設計,
能自動穩合所使用的各種倍率的鏡頭.
在紫外光雷射光源方面,
Leica TCS SP2 已有自動控制的針孔聚光鏡
( Pinhole Lens ).
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| 雷射光源無完全充滿鏡頭的照明瞳孔, 損失光學解析
,
雷射光源超出鏡頭的照明瞳孔太多, 損失螢光強度 |
最佳瞳孔照明提供 :
l
最佳鏡頭解析 ( 高解像力 )
l
最佳照明效益 ( 影像鮮明 )
l
最適宜多光子影像的螢光擷取,
最適宜低功率或低強度的雷射
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此
7 個可旋轉的旋鈕,
每個旋鈕的操控參數,
都可任意選用與設定,
如每一個
PMT 的
Gain 及
offset, Pinhole 的口徑調整,
Z-縱深調焦,
Zoom 變焦,
…..等.
所有軟體的操控,
可設定於此
7 組旋鈕,
可方便使用人員快速的擷取影像與調整最佳的條件.
無須去開啟一大堆視窗,
用滑鼠去推拉一些功能.
往往影像擷取必須快速取得最佳條件,
否則,
過長的時間會造成樣品過度曝晒於雷射下,
樣品壞死,
螢光染劑過速漂白 |
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共軛焦顯微鏡建議使用專屬的鏡頭,
其於
R, G, B, 各作有特別的修正
( correction ), 能提供最高的光學穿透與解析
( Point-spread resolution ). 故, 其有別於一般鏡頭.
例如
: PL-APO 63x/1.32 CS Oil ( 有
CS 標示,
即代表
Confocal System 專屬鏡頭
)
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| 新一代
405 nm
藍光雷射 (
Blue laser, solid-state Diode blue laser )
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Leica
的 594
nm Laser, 對 Texas
Red 激發效率最佳. |
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Leica
TCS SP2 AOBS
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AOBS ( Acousto Optical Beam
Splitter ) 技術原理 |
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Single or multiple excitation laser lines are directed
to the specimen by acousto-optical deflection. The
returning fluorescence light is passing the device
undisturbed and is directed to the confocal pinhole
and the prism spectrophotometer detector. ( Left :
AOBS ). Conventional beam splitters are not very
efficient for fluorescence ( Right : Blue curve ) They
have fixed characteristics and wide bands. The AOBS
has higher transparency, sharp bands and neutral
transmission across the visible spectrum. The neutral
characteristics of the AOBS enables recording of real
fluorescence spectra, un-modulated by beam splitter
transmission. No transmission " holes " exists. |
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| Leica
AOBS : Perfect
selectivity ( 0.6 - 2 nm typical )
programmable
multi-chroic up to 8 channels, 8 sharp bands can be
selected sequentially or simultaneously. The rest of
spectrum is free for collecting fluorescence light.
Conventional
beam splitters are not very efficient for
fluorescence. They have fixed characteristics and
wide bands. The AOBS has higher transparency, sharp
bands and neutral transmission across the visible
spectrum. |
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| Dichroic
beam splitter ( optical filter ) |
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Leica
AOBS |
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FITC,
TRITC, excitation with 488 nm and 543 nm laser
lines. The Leica TCS SP2 AOBS adapts beam splitter
characteristics dynamically to each excitation line
( Blue ). The result is optimal fluorescence
collection efficiency for each dye. The Fluorescence
light collection efficiency of the AOBS is far
higher than with conventional beam splitter. A
comparison of dual channel acquisition of FITC and
TRITC shows that the AOBS-enabled system collects
30% more FITC emission and 20% more TRITC emission
light. |
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| Dichroic
Beam Splitter ( optical filter ) |
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Leica
AOBS |
| Mouse
cerebellum, Cy3-Cy5 : Identical instrument
conditions. ( Laser power in focal plane, parameter
settings, specimen volume ) : Leica AOBS is more
sensitive, needs less laser power, less gain, allows
faster imaging speed. |
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Leica TCS SP2 相關技術資料與規格
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Microscope,
Upright, HC |
Leica DM R, RE,
RXE, RXA 2 |
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Leica DM 6000 (
New - 2004 ) |
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Leica DM LFSA (
Fixed Stage Microscope ) |
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Microscope,
Inverted, HC |
Leica DM IRB,
DM IRBE, DM IRE 2. |
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Z drive |
High precision
Galvo-Z-drive : 170 micrometer travel, XYZ : 40 nm
resolution, XZ< 1 nm resolution. |
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Internal
motorization of Leica RE, RXE, RXA2, IRBE, IRE 2
and DM 6000 ( Z-wdie ) |
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Lasers &
Attenuation switching modules |
Ar UV
351, 364 nm |
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He-Cd 442
nm |
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Ar 457 nm, 476
nm, 488 nm, 514 nm |
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Ar-Kr 488 nm,
568 nm, 647 nm |
|
Kr 568 nm |
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CW Solid-State
561 nm ( NEW ) |
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He-Ne 543 nm |
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He-Ne 594 nm (
NEW orange ) |
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He-Ne 633 nm |
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DPSS 430 nm |
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Diode Laser 405
nm ( 20 mW ) |
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Ti:Sapphire
Lasers ( for Multi-Photon Imaging ) |
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AOTF, 4 or 8
channels ( for Visible range ) |
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AOTF, UV range |
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EOM, IR range (
Electro-optical modulator ) |
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Laser Merge
Module for 4 lasers. |
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Confocal Unit |
Optics : |
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User-switchable
between Leica microscope ( Upright and Inverted ) |
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Alignment-Free
for lifetime |
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3 individual
ports for external lasers for up to 6 lasers
connected simultaneously |
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Programmable
8-channel AOBS Beam Splitter (
for SP2 AOBS only ) |
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Spectral range
of Detector optics : 400 - 850 nm, programmable. |
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UV and MP
possible in one system ( UV-VIS-MP ) |
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Fiber coupling
( MP : either fiber coupling or direct mirror
coupling ) |
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Field-upgradable
to MP microscopy |
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UV system with
individual objective correction lens |
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Adjustable
PUPIL illumination |
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Single pinhole,
variable diameter size. |
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Scanner : |
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K-scanner with
two independent galvanometers. |
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Line frequency
: up to 2000 lines/sec. |
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Frame rate : 3
fps ( 512 x 512 pixels ), 20 fps ( 512 x 32 pixels
) |
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Scan resolution
: up to 4096 x 4096 pixels |
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Scan Zoom 1 -
32x |
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Scan Rotation :
-2 to +92 degrees |
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Scan field : 22
mm diagonal in intermediate image plane |
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Control Unit |
Detectors |
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Highly
sensitivity prism spectrophotometer detector, 1 -
4 simultaneous channels. |
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Continuously
adjustable bandwidth and center wavelength |
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Spectral
steepness factor less than 1 |
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Low noise
photomultipliers |
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Up to 12 bits
digitization per channel |
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Transmitted
light / DIC Detector |
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Non-Descanned (
NDD ) Dual channel transmission detector ( MP ) |
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Non-Descanned (
NDD ) Dual channel Reflection & Fluorescence
detector ( MP ) |
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FLIM detector (
for MP-FLIM or D-FLIM pulsed diode 405 nm ) |
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FCS detector (
for Fluorescence Correlation Spectroscopy ) |
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Optional
External Detector |
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Programmable
Panel-Box, user-configurable |
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Electronics |
Scanner control
system with FRGA ( Field-programmable gate arrays
) |
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Trigger-IN and
Trigger-OUT ports |
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8-Detector
channels, 12-bits digitization, Simultaneous. |
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Ultra-Wide SCSI
interface to PC |
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High
performance PC Workstation ( Windows XP
environment ) |
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One or Two
monitor configuration |
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Software |
Leica LCS
software package |
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Fully
operator-configurable user interface |
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Intuitive and
guided |
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Context-sensitive online help system |
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Multi-dimensional series acquisition ( up to 7
parameters simultaneously ) |
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Programmable
manual control panel |
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Region of
Interest scan |
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Excitation line
/ Frame multiplexing |
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Emission
spectrum recording |
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Multi-color
restoration, spectral un-mixing |
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Advanced Time
lapse recording |
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Surface
reconstruction |
|
Multiple
measurement functions |
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Physiology
application software package |
|
Multi-Color
application software package |
|
FRET
application software |
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FLIM
application software |
|
FCS application
software |
|
FRAP
application software |
|
3D
reconstruction with multiple reconstruction &
rendering functions |
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Macro developer
software |
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De-convolution
software |
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Material
software |
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The 2nd
workstation package ( off-line ) |
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Software new
function |
Leica LCS
MicroLab ( New ) |
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Dye separation |
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Pixel intensity
readout in documentation-viewer |
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Offline phase
correction |
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Zoom-IN
function combined with corp function ( AOTF
control, ROI-scan ) |
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Panning
function during scanning available with Panel Box |
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Objectives |
Leica PL-Fluotar,
PL-APO objectives ( CS ) |
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Live-Cell
Chamber |
Temperature &
CO2 controlled chamber system |
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Wide-Field
Imaging |
Cooled CCD
Camera with software, workstation. |
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Motorized
microscope stage |
Programmable
motorized XY-scanning stage |
 請參考
Leica LCS software 詳細說明 |
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詳細規格,
請洽本公司共軛焦小組 |
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其他相關資料下載及連結 |
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