Movie of mouse oocyte from transgenic CAG::H2B-EGFP mouse stained with SiR-tubulin. Chromosomes (H2B) are pseudocolored in red, microtubules in green. Courtesy of Petr Solc, Institute of Animal Physiology and Genetics at Academy of Sciences of the Czech Republic, Brno. View more details at www.cytoskeleton.com/spirochrome SiR-Actin and SiR-Tubulin by Spirochrome, Ltd. provided by Cytoskeleton, Inc. See cytoskeleton.com for more details.

技術

SPIROCHROME technology is based on the proprietary fluorophore silicon rhodamine (SiR). SiR is a bright and photostable rhodamine-like dye. Its key features are its cell permeability, fluorogenic character and compatibility with super-resolution microscopy The fluorescence excitation and emission of SiR are in the far-red, reducing phototoxicity in live-cell imaging experiments. SiR is compatible with most microscopes as it can be used with standard Cy5 settings. The combination of all these properties set SiR-based probes apart from other fluorescent probes. Read more in this Nature Chemistry paper about the properties of SiR.

Fluorogenic probes for live-cell imaging of the cytoskeleton
Our first two products are SiR-actin and SiR-tubulin, two powerful fluorescent probes for live-cell imaging of the cytoskeleton. SiR-actin and SiR-tubulin were recently introduced in a landmark paper published in Nature Methods. The probes combine minimal cytotoxicity with excellent brightness for fluorescence imaging of actin and tubulin. Combined with super-resolution microscopy, SiR-actin and SiR-tubulin permit live-cell imaging of the cytoskeleton with unprecedented resolution.
SiR-actin and SiR-tubulin can be used without transfection and without washing steps. An experiment that highlights these features is the use of SiR-actin to stain the actin fibers of erythrocytes by simply adding SiR-actin to whole blood. Furthermore, their far-red excitation and emission spectra make them compatible with genetically encoded reporters.

Create your own SiR-based probes
SiR derivatives exist in equilibrium between a non-fluorescent spirolactone (“OFF” state) and a fluorescent zwitterion (“ON” state). Aggregation of SiR derivatives favors the “OFF” state, whereas their interaction with polar protein surfaces switches the fluorophore into the “ON” state. Therefore, SiR-based probes are fluorogenic and become fluorescent only when binding to their cellular target. By coupling different ligands to SiR, for example using our NHS ester or by starting from the free acid, you can now create your own powerful probes. More information on the required properties of the ligand can be found here. Our chemists are happy to help you to convert your ligand into a fluorogenic probe; please contact us for further discussions!

References:

1. Fluorogenic probes for live-cell imaging of the cytoskeleton, G. Lukinavičius et al., Nature Methods, 11, 731–733 (2014)
2. A near-infrared fluorophore for live-cell super-resolution microscopy of cellular proteins G. Lukinavičius et al., Nature Chemistry, 5, 132–139 (2013).

應用發表文獻參考

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SiR-actin Kit & SiR-tubulin Kit

“Fluorogenic probes for live-cell imaging of the cytoskeleton”; G. Lukinavičius, et. al.; Nature Methods 11, 731–733, 2014.
The landmark paper introducing the probes SiR-actin and SiR-tubulin. This article contains a thorough evaluation of the probes in live-cell imaging conditions, including SIM and STED imaging. A must read!

“Polarized endosome dynamics by spindle asymmetry during asymmetric cell division”; E. Derivery, et. al.; Nature, 528(7581): 280-2851, 2015.
An excellent Nature article in which the authors show the mechanism of specific endosome segregation during asymmetric division. With the help of SiR-tubulin and other reporters fused to FPs, robust evidence of an asymmetric distribution of microtubules along the mitotic axis is shown. This uneven microtubule density is at the basis of segregation.

“STED Nanoscopy Reveals the Ubiquity of Subcortical Cytoskeleton Periodicity in Living Neurons”; E. D’Este, et. al.; Cell Reports, Volume 10 , Issue 8 , 1246 – 1251, 2015.
A remarkable article from the group of the Nobel Prize winner Stefan Hell showing how actin organizes into ring-like structures in living neurons using STED nanoscopy. SiR-actin is the key reagent that allowed to images these periodic structures that are below the conventional diffraction limit.

“Subcortical cytoskeleton periodicity throughout the nervous system”; E. D’Este, et. al.; Scientific Reports, 6, 22741, 2016.
In this article, which was built on the previous article in this list, D’Este et. al. (group of Nobel prize winner Stefan Hell) brilliantly used SiR-actin to systematically look by STED nanoscopy for ring-like structures of actin within many cell types of the nervous system. They showed that this particular actin organization is found in almost all neural cells. Stunning images with impressive resolution.

“Dynamic actin filaments control the mechanical behavior of the human red blood cell membrane”; D. S. Gokhin, et. al.; Mol. Biol. Cell; February 25, 2015.
This article challenges the idea that actin filaments under the plasma membrane of red blood cells (RBC) are not dynamic. Further, evidence is shown that these dynamic actin filaments play a role in the mechanical properties of the RBCs. SiR-actin was successfully used in a FRAP experiment to demonstrate the dynamic behavior of F-actin in live RBCs. 

“A marginal band of microtubules transports and organizes mitochondria in retinal bipolar synaptic terminals”; M. Graffe, et. al.; J. Gen Physiol. Vol. 146 No.1: 109-117, 2015.
This paper features amazing images of retina bipolar cells of goldfish containing giant synaptic terminals stained with SiR-tubulin. The authors show an unusual arrangement of a thick band of microtubules emerging from the axon and that loop around the terminal periphery throughout the presynaptic space of the synaptic terminal.

“A cleavable cytolysin-neuropeptide Y bioconjugate enables specific drug delivery and demonstrates intracellular mode of action”; V. M. Ahrens, et. al.; J. Control. Release; 209:170-178, 2015.
The authors report a cleavable cytolysin–neuropeptide Y bioconjugate that specifically targets receptors overexpressed by cancer cells. The conjugate internalizes and releases intracellularly a microtubule poison. The treated cells were subsequently stained with SiR-tubulin and it was shown that their microtubules depolymerized and nuclei fragmented.

“A Bright Dye for Live-Cell STED Microscopy”; S. Pitsch, I. Köster, 2015.
A joint application note from Spirochrome and the world leading microscope manufacturer Leica that underscores the use of SiR-tubulin and SiR-actin in live cell STED microscopy .

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SiR-DNA Kit

“SiR–Hoechst is a far-red DNA stain for live-cell nanoscopy”; G. Lukinavičius et. al.; Nat. Commun. 6:8497 doi: 10.1038/ncomms9497 (2015).
This article introduces the probe SiR-DNA (named SiR-hoechst in the article). It shows how SiR-DNA outperforms other live cells DNA stains both in terms of toxicity and specificity in live-cell imaging conditions.

“Back to the roots: segregation of univalent sex chromosomes in meiosis”; G. Fabig et. al.; Chromosoma, 1-10 (2015).
Here SiR-DNA was used to track sexual chromosomes during meiosis in different„ nematode species, including C. elegans.

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SiR-COOH, SiR-NHS, SiR-tetrazine, SiR-azide & SiR-alkyne reagents

“A near-infrared fluorophore for live-cell super-resolution microscopy of cellular proteins”; G. Lukinavičius, et. al.; Nature Chemistry 5, 132–139, 2013.
Another landmark paper introducing the carboxylated SiR-fluorophore SiR-COOH and its use for the the generation of fluorogenic substrates for the self labeling tags SNAP-tag, CLIP-tag and Halo-tag as well as SiR-tetrazine.

“Superresolution imaging of the Golgi in live cells with a bioorthogonal ceramide probe”;R. S. Erdmann et al.; Angew. Chem. Int. Ed.; 53: 10242–10246 (2014).
In this article SiR-tetrazine is used together with a novel clickable ceramide probe. This combination allowed to record superresolution images (STED) of the golgi in live cells.

“Genetic Code Expansion Enables Live-Cell and Super-Resolution Imaging of Site-Specifically Labeled Cellular Proteins”; C. Uttamapinant , et. al.; J. Am. Chem. Soc., 2015, 137 (14), pp 4602–4605.
A bright application of SiR-tetrazine which, in combination with unnatural amino acid incorporation technology, yields amazing superresolution images (STORM) of proteins in live cells.

“Red Si–rhodamine drug conjugates enable imaging in GFP cells”; E. Kim, et. al.; Chem. Commun., 50, 4504-4507, 2014.
This article underscores the superiority of carboxylated SiR fluorophore to create custom fluorescent probes that are cell permeable, in the far-red, fluorogenic and highly specific. Conjugation of SiR-COOH and the PARP inhibitor Olaparib produced a fluorescent probe to report on the localization of PARP1 and PARP2 in live cells.




SiR-actin Kit
活細胞F-纖維肌動蛋白螢光標記探針





 

介紹

 
SiR-actin是基於矽羅丹明(SiR) 螢光團且肌動蛋白結合 天然產物　jasplakinolide。
 
Sir肌動蛋白可在活細胞中標記　F- 肌動蛋白，特異性高，背景低。
 
SiR- actin　的主要特徵是：
 

1. 遠 紅光吸收和發射波長，
2. 細胞通透性好，
3. 螢光特性，
4. 與超 分辨顯微鏡　(STED & SIM)　的相容性。

 
這些前所未有的在單一 探針中所結合的屬性，使SiR-actin處於卓越的應用前沿。
 

 

存儲和處理

 
收到產品請即刻儲存在-20°C以下。用無水DMSO（二甲 基亞碸）製備該化合物的溶液。
 
使用後請將溶液溫度保持在- 20℃以下。試劑應在打開前加熱至室溫。
 
如果儲存得當，此化 合物可以保持幾個月時間的穩定性。注意:DMSO（二甲基亞 碸）溶液處理時應特別小心，因為DMSO（二甲基亞碸）可促 使有機分子進入組織。需要按照當地有關規定處理試劑。
 

標定流程：
 
注意:
該流程使用黏附在蓋玻片上的人成纖維細胞進行優化，並已在其他常見細胞系中進行過驗證。此流程的建議為基本初始參 考點，具體要根據經驗確定每種細胞類型的最佳標記條件。
 
SiR-actin是基於藥物jasplakinolide穩定化處理的肌動蛋白，它會因此改變 活細胞中的肌動蛋白動力學。對於所培養的HeLa 細胞，有絲分裂期間保持濃度在 3 M SiR-actin, 濃度高於100 nM會導致細胞增殖 指數減少。對於長時間成像實驗，肌動蛋白動力學關鍵，我們建議將SiR-actin濃度保持在100 nM以下。如果是其他實驗目的， 推薦 使用 1 M SiR-actin進行染色.
 
製備 1 mM 原液
 
把瓶中的SiR-actin 溶解在50 μL 無水DMSO（二甲基亞碸）中製備成一份1 mM 原液， 此溶液要存儲在-20°C以下。 不要把溶 液分成小份, 會致使更快衰減，同時化合物不會因多次迴圈冷凍而改變。若保存得當, 此溶液可以三個月或者更長時間穩定性。如果 需要準確測定原液的濃度，請在99l含有0.2 % SDS的PBS中稀釋1 l 的1 mM 原液，室溫下經過15分鐘，測量在652 nm的吸光度，再 利用上述消光係數計算濃度。
 
製備染色溶液
 
將SiR-actin在細胞培養基(如DMEM + 10%胎牛血清)中稀釋至所需濃度，並短暫攪拌混勻。 由於染色效率取決於細胞系，故第一 次嘗試時，建議利用1M染細胞，以便快速獲得較強的染色效果。在後續實驗中進一步降低SiR-actin的濃度，直到獲得最佳的染色
 
效果(見下表的 標定濃度 & 培養時間)。 一些細胞系表現較高水準的外排泵，會導致SiR-actin 染色效果不佳。在染色溶液中加入 的10M維拉帕米（一種廣譜射流泵抑制劑），在染色液中通常能大大改善染色效果。請見 www.spirochrome.com/verapamil 查閱有 關使用維拉帕米與SiR探針的更多資訊. 僅請使用新鮮的染色溶液，並避免多重使用。
 

細胞製備和染色

讓細胞生長在蓋玻片上, 通常使用玻璃底的培養皿或者玻璃底的多孔板。當細胞達到所需的密度時，用染色溶液代替培養基，並 確保所有細胞都溶液被覆蓋。將細胞置於37℃、含5% CO2的濕化環境中培養。
 
 
 
 
 
參照下表中的標記時間以作為探針濃度的依據 :
 

探針濃度 (nM)	建議標記時間 (h)*
> 1000	0.5 - 1
500	3 - 4
200	4 - 6
< 100	6  - 12

 

* 這些標記時間是針對人成纖維細胞所確定，根據所用細胞系可能有所不同

 
注意:
在多聚甲醛(PFA)固定細胞中，相對使用標準的鬼筆環肽（phalloidin）染色方案，SiR-actin對F-actin的染色效果與鬼筆 環肽（phalloidin）相同.
 

細胞成像

使用標準的Cy5設備即可很好的做SiR-actin的成像。標記後，無需清洗步驟，活細胞可立即成像。也可選擇用不含探針的新鮮培 養基替換染劑溶液的步驟做簡單清洗，通常可以提高信噪比。如果進行時序成像，建議在整個實驗過程中，保持探針濃度等於或低於 100 nM，避免探針對肌動蛋白動力學的干擾(減少細胞增殖)，以獲得穩定的信號。 如果在成像前清洗細胞，染色可以持續幾個小時
 

參照:

用於細胞骨架活細胞成像的螢光探針，G. Lukinavičius et al., Nature Methods, 11, 731–733 (2014)
Spirochrome 產品是用於研究目的的高品質試劑和材料. 這些產品必須由具有潛在危險化學品處理經驗的合格技術人員使用，或在 他們的直接監督下使用. 請認真閱讀針對每個產品提供的材料安全資料表，其他監管也可以考量適用. Spirochrome產品和產品應用都 涉及專利和正在申請的專利

 

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SPY505-DNA 
活細胞螢光DNA標記探針






介紹
 
 
SPY505-DNA
是基於我們SPYTM系列的無毒亮綠色的活細胞 核染料。 其優化的結構可以快速標記活細胞和固定細胞中的 DNA，具有高特異性和低背景。 SPY505-DNA不需要基因操作或 螢光蛋白的過表達，即可染活細胞或固定細胞的細胞核。其吸 收和發射類似於螢光素或Alexa488TM。 SPY505-DNA 可與 SPY555, SPY595, SPY650, SPY700, SiR, RFP或螢光探針一起進行多色成像。SPY505-DNA 可以用標準的(FITC) or YFP 濾鏡 設備進行成像。其可在活體或固定細胞和組織中做 widefield, confocal, SIM or STED成像. 
 
 
包裝：
1小瓶SPY505-DNA (凍幹)  探針特性
 
光譜 :

Absorbance maximum λabs	512 nm
Fluorescence maximum λfl	531 nm
Works on fixed cells?	yes, PFA and methanol
Probe quantity	100 staining
Fluorescence lifetime	4.0 ns
STED depletion wavelength	660 nm
Shipping  room temperature Storage	-20°C

 
              
儲存和處理

收到產品即刻儲存在 -20°C 以下。凍幹探針可在室溫下保持超過一周的穩定性，在-20°C，可以保持超過12個月的穩定性。使用無 水DMSO（二甲基亞碸） 對SPY505-DNA進行復原，建議使用新的或剛打開的無水DMSO（二甲基亞碸）來製備1000x的原液。即使在-20℃ 時，若DMSO與空氣和水分接觸時也會產生衰變產物，進而大大降低溶液中探針的保存期限。在使用後，請將探針的1000x原液保持在-20℃ 以下。試劑應在打開前加熱至室溫。如果復原和儲存得當，此1000x原液可以保持3個月的穩定性。
 
注意:
DMSO（二甲基亞碸）溶液處理時應特別小心，因為DMSO（二甲基亞碸）可促使有機分子進入組織。需要按照當地有關規定處 理些試劑
 
標記流程：
注意: 該流程使用黏附在蓋玻片上的HeLa細胞進行優化，並已在其他常見細胞系中進行過驗證。此流程中的建議為基本初始參考點，具體要根據經驗確定每種細胞類型的最佳標記條件， SPY505-DNA 是基於DNA小溝槽結合分子雙苯醯亞胺. 它在高劑量時可
能改變活細胞的DNA代謝. 因此，如果想要做長時間(>12h)成像實驗，建議稀釋倍數1000倍或更高。若是其他實驗目的，建議使用 1000倍稀釋的SPY505-DNA進行染色
 
1.  製備 1000x 原液 
 
向盛放SPY505-DNA的瓶中加入 50 μL 無水DMSO（二甲基亞碸）製備1000x 儲存液， 建議使用新的或剛打開的無水DMSO（二 甲基亞碸）來製備1000x的原液。即使在-20℃時，若DMSO與空氣和水分接觸時也會產生衰變產物，從而會大大降低溶液中探針的 保存期限。在此階段, 溶液可能顯色也可能不會顯色，但對探針性能都沒有影響。用過後的溶液需要保存在-20°C 或以下，不要 把1000x存儲液分裝成小份, 會造成更快衰減，探針也不會因多次迴圈冷凍而變性。如果儲存得當，可以保持原液3個月的穩定性。
 
2.  製備染色溶液
 
將SPY505-DNA 在細胞培養基(如DMEM + 10%胎牛血清)中稀釋1倍，並短暫攪拌混勻。如果不是進行一步稀釋，請使用DMSO來 準備過渡稀釋（使用水性緩衝液來準備過渡稀釋，則會導致探針聚合體形成），然後快速進入步驟3。由於染色效率取決於細胞系， 所以，建議在第一次嘗試時，用1000倍稀釋法去染細胞，並在後續實驗中優化SPY505-DNA稀釋係數，直到獲得最佳染色效果(見下 表的 標定濃度 & 培養時間). 僅請使用新鮮的染色溶液，並不要多重使用

3.  細胞製備和染色.
 
讓細胞在蓋玻片上生長, 通常使用玻璃底的培養皿或者玻璃底的多孔板。 當細胞達到所需的密度時，用步驟2中配製的新鮮 染色液代替培養基，並確保所有細胞都被溶液覆蓋。再將細胞置於37℃、含5% CO2的濕化環境中培養
 
參照下表中的標記時間以作為探針濃度的依據  :

稀釋係數	建議標記時間 (h)**
1000 or less	1
2000	2
> 2000	4

 
Note: SPY505-DNA在多聚甲醛(PFA)和甲醇固定細胞中對DNA進行染色
 
 
4.  細胞成像
 
使用標準的(FITC) 或 YFP 成像設備可對SPY505-DNA進行很好的成像。標記後，無需清洗步驟，活細胞可立即成像。也可選 擇用不含探針的新鮮培養基替換標記溶液步驟做簡單清洗，通常可以提高信噪比 。如果做時序成像實驗，建議在整個實驗過程中， 將探針置於成像介質中，以獲得恒定的信號。 如果在成像前清洗細胞，染色可以持續幾個小時。
 
請注意：
SPY505-DNA可以在360-390nm被激發，釋放約450nm的螢光，這是由於探針的DNA結合部分的螢光引起的
 
* 依據情況: 每次實驗，使用0.5 ml 一倍濃度的探針染色液，通過減小體積或探針濃度，可以進一步增加染色實驗次數。
 
** 標記次數是根據HeLa細胞確定的，使用的細胞系可能有所不同
 
Spirochrome 產品是用於研究目的的高品質試劑和材料. 這些產品必須由具有潛在危險化學品處理經驗的合格技術人員使用， 或在他們的直接監督下使用. 請認真閱讀針對每個產品提供的材料安全資料表，其他監管也可以考量適用. Spirochrome產品和產品應用都涉及專利和正在申請的專利，SPY是一個注冊商標。 

 

Learn more about the SPY™ Probes by Spirochrome at tebu-bio. SPY™ probes are new colour tools (green, orange, red and far red) which enable you to efficiently label DNA (nucleus), Actin and Cytoskeleton on living and fixed cells. These new probes retain the valued properties of the much-used SiR-probes - they are non-cytotoxic, cell permeable, highly selective, and STED/SIM Compatible.


 

   

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DNA Research